Topmusicanswers
Problemen met PCR- en RT-PCR-amplificatie oplossen
| Probleem | Mogelijke oorzaak |
|---|---|
| Geen banden op gel | Verlengingstijd was te kort |
| Thermal cycler was niet op de juiste temperatuur | |
| Extra, niet-specifieke banden op gel | Primers zijn gehybridiseerd met een secundaire plaats op de sjabloon |
| DNA-besmetting werd geïntroduceerd in primers of buffers |
- Wat veroorzaakt PCR-mislukking??
- Hoe los je een PCR-probleem op??
- Wat zou u doen als de PCR-amplificatie van een monster is mislukt??
- Wat gebeurt er als u te veel primer toevoegt aan PCR?
Wat veroorzaakt PCR-mislukking??
Meestal is het eerste wat onderzoekers doen een defect enzym of reagens de schuld geven wanneer een experiment mislukt, maar met PCR is dit eigenlijk minder waarschijnlijk de oorzaak van het mislukken. Vaker zijn diepere interne problemen zoals primerontwerp, thermocyclerparameters of niet-specifieke binding aan andere templatesequenties de oorzaak.
Hoe los je een PCR-probleem op??
Controleer de amplificatielengte van de geselecteerde DNA-polymerasen. Gebruik DNA-polymerasen die speciaal zijn ontworpen voor lange PCR. Kies DNA-polymerasen met een hoge processiviteit, die lange doelen in een kortere tijd kunnen versterken. Verlaag de gloei- en verlengingstemperaturen om de binding van de primer en de thermostabiliteit van het enzym te helpen.
Wat zou u doen als de PCR-amplificatie van een monster is mislukt??
Als een amplificatiereactie mislukt en u vermoedt dat de DNA-template is verontreinigd met een remmer, voeg dan het verdachte DNA-preparaat toe aan een controlereactie met een DNA-template en primerpaar dat in het verleden goed is geamplificeerd .
Wat gebeurt er als u te veel primer toevoegt aan PCR?
Het gebruik van hogere concentraties primers kan de volgende effecten hebben: Als de primers in staat zijn om dimeren te vormen, leidt het verhogen van hun concentratie alleen tot de vorming van primer-dimeren en verbetert niet de amplificatie van het gewenste PCR-product.
