Te veel sjabloon in pcr

De hoeveelheid totaal DNA in een PCR heeft een duidelijk effect op de uitkomst van een PCR-procedure. Het gebruik van te veel totaal DNA resulteert in opeengepakt DNA in de beperkte ruimte van het reactievat en kan leiden tot valse priming en zelfs slechte DNA-synthese als gevolg van de belemmerde diffusie van grote Taq-polymerasemoleculen.

1. Hoeveel sjabloon moet ik toevoegen aan PCR?
2. Kan te veel primer PCR . remmen?
3. Waardoor kan een PCR-reactie mislukken??
4. Hoeveel DNA is genoeg voor PCR?

Hoeveel sjabloon moet ik toevoegen aan PCR?

Hoewel in theorie één molecuul van de matrijs voldoende zou zijn, worden doorgaans aanzienlijk grotere hoeveelheden DNA gebruikt voor een klassieke PCR, bijvoorbeeld tot 1 µg genomisch zoogdier-DNA en slechts 1 pg plasmide-DNA (1).

Kan te veel primer PCR . remmen?

Verontreinigingen in de dNTP-mix kunnen leiden tot onvolledige of onjuiste amplificatie of PCR-remming. Gebruik dNTP's van hoge kwaliteit. Het gebruik van een overmatige concentratie van primers kan de kans vergroten dat primers niet-specifiek binden aan ongewenste plaatsen op de template of aan elkaar.

Waardoor kan een PCR-reactie mislukken??

Het vergeten van slechts één component van de PCR-reactie, of dat nu de DNA-polymerase, primers of zelfs het sjabloon-DNA is, zal resulteren in een mislukte reactie. De eenvoudigste oplossing is om de reactie te herhalen. ... Als er hierna nog steeds geen PCR-product is, is de kans groot dat iets anders uw reactie belemmert.

Hoeveel DNA is genoeg voor PCR?

In een typische reactie van 50 µL zijn 1-2 eenheden DNA-polymerase voldoende voor amplificatie van doel-DNA. Het kan echter nodig zijn om de enzymhoeveelheden aan te passen met moeilijke sjablonen. Als er bijvoorbeeld remmers in het DNA-monster aanwezig zijn, kan het verhogen van de hoeveelheid DNA-polymerase de PCR-opbrengsten verbeteren.